清肠栓对大鼠溃疡性结肠炎急性期模型CINC一1的影

　　溃疡性结肠炎(UC)是一种结肠黏膜及黏膜下炎症疾病。其病因尚不十分清楚。该病以持续或反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓血、里急后重为主要症状，可将其归属于中医学""肠游""、""大瘕泄""、""下利""等病证范畴。

　　研究表明，中性粒细胞通过微血管循环进入黏膜内，并持续存在于活动性炎症的全过程中。中性粒细胞趋化因子可以趋化中性粒细胞向病变结肠黏膜聚集.，同时能激活中性粒细胞，促进中性粒细胞呼吸爆发，产生大量毒性物质，加重炎症反应。清肠栓具清热解毒、活血祛瘀之功效，临床治疗UC急性期中医辨证属热毒血瘀的患者效果显着。为进一步探讨清肠栓治疗UC急性期的作用机理，本研究在以往相关研究的基础上，基金项目：国家自然科学基金资助项目(No．30772801)△通信作者- 1OO5__· 研究报告·采用ELISA技术。观察清肠栓对大鼠溃疡性结肠炎急性期模型结肠黏膜CINC一1含量的影响。现报告如下。

　　1 材料与方法1．1 材料清洁级雄性SD大鼠48只，体质量(180+20)g，由上海中医药大学动物实验中心提供。清肠栓(上海中医药大学附属龙华医院药房提供)；柳氮磺胺吡啶(SASP，山西三九同达药业有限公司生产．国药准字H10900091)。5％2，4，6一三硝基苯磺酸(TNBs)，美国Sigma公司；CINC一1 Elisa试剂盒，美国R&D公司。

　　酶标仪(Bio-Tek ELX800NB)；KC4酶标分析软件。

　　1．2 分组与造模将48只大鼠常规适应性饲养1周后(体质量达到要求)，随机分为正常组、模型组、清肠栓组、SASP组等4组，每组各12只。除正常组大鼠外，其余均予造模。36只造模大鼠禁食不禁水24 h后，给予2％戊巴比妥钠(45mg／kg)腹腔麻醉。按照100 mg／kgTNBs的剂量造模，用lmL注射器抽吸TNBs原液(0．20 mL／100 g SD大鼠)，继续抽吸0．25 mL的5O％乙醇混合后，用改良后的直灌胃针插入肛门上段8 cm后注入混合试剂。然后用金属夹夹大鼠肛门2 h，同时释放大鼠归笼。大鼠造模后第3日，开始灌肠给药。模型组：0．9％氯化钠注射液0．2 mL／100 g大鼠。清肠栓组：

　　给药前加入蒸馏水配成100 mg／mL的清肠栓液，实验时按照20 mg／100 g大鼠给药，约相当于人体剂量的6．25倍。SASP组：柳氮磺吡啶片给药前去掉包衣．研磨成细粉，加入蒸馏水配成200 mg／mL的混悬液，实验时按照40 mg／100 g大鼠给药。约相当于人体剂量的6．25倍。上述剂量按照动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表I2 算出。灌肠方法与造模时相同。连续给药7 d。

　　l-3 标本采集 给药第7日后，48只大鼠禁食不禁水24 h后进行称质量，标本采集。麻醉处死后迅速剖取远端结肠(肛门之上8 cm至肛门)，选择性取材(挑取溃疡最明显处病变肠段，若无溃疡则选取红肿糜烂较明显处病变肠段)沿纵轴切开，所取结肠组织分成两部分，一部分置于标本体积10倍以上的10％ 甲醛中固定，准备显微镜下进行大体形态观察。另一部分装入Eppendorf管后，迅速置于液氮中，然后转入一70~C冰箱保存，待制备组织上清。

　　1．4 病变结肠大体形态损伤评分 将甲醛固定后的结肠标本肠黏膜层向上，平铺于白色的硬纸板上，大头针固定后，用放大镜观察黏膜的急性损伤程度并评分(评分标准参照Morris~。 评分法修改确定)。0分为无损伤；1分为黏膜充血、水肿，但未出现溃疡；2分为黏膜充血、水肿、轻度糜烂，有单个溃疡；3分为黏膜充血。

　　水肿、中度糜烂，有单个溃疡；4分为黏膜充血、水肿、高度糜烂，有多处溃疡；5分为黏膜重度糜烂，或伴有大片黏膜坏死发黑，与周围组织粘连，有>1 cm溃疡。

　　1．5 组织上清液制备取大鼠结肠组织，用预冷的生理盐水按9：1即(按900 L 0．9％氯化钠注射和100 mg组织的比例)人试管，冰浴匀浆，继用高速冷冻离心机4 cc离心，4000 r／min，离心30 min，用移液器收集分离出的上清液，用0．5 mL dorf管分装，放置一20℃冰箱保存，避免反复冻溶，测定时在室温下自溶。

　　1．6 ELISA检测 采用双抗体夹心法，格按照试剂盒说明书操作。首先建立标准曲线，设标准孔8孔。第1孔为空白对照，其余7孔每孔加入样品稀释液100 L，第2孔加标准品100 L，混匀后用加样器吸出100 L，移至第3孔，如此反复作对倍稀释至第8孔。待测品孔中每孔加入待测样品100 L。将反应板置37℃反应120 min。洗涤液充分洗涤4～6次，滤纸上印干。每孑L加入一抗工作液5O L，反应板充分混匀后置37℃60 min。洗涤液充分洗涤4-6次．滤纸上印干。每孔加酶标抗体工作液5O L，反应板充分混匀后置37℃30 min。洗涤液充分洗涤4～6次，滤纸上印干。每孔加入底物工作液100 L，置37。【=暗处反应5～10 min。每孔加入1滴终止液混匀。在450 nm处测吸光值。KC4酶标分析软件进行结果分析。

　　1．7 统计学处理应用SPSS11．5 forwindows统计软件。计量资料以( )表示，组间差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，经方差齐性检验后，方差齐时用Seheffe法，方差不齐时用Games-Howell法。P<0．05为差异有统计学意义2 结果2．1 大鼠一般情况 大鼠造模后第1日开始逐渐出现大便次数增多、稀便、血便、大便末端有黏液或脓点、拱背、厌食、萎靡、懒动等表现；造模后第3日症状达到高峰，大便完全为稀便、并且见有黏液脓血便；给药第7日时，模型组仍有血便，SASP组大鼠黏液脓血便消失，但见有软便；清肠栓组大鼠黏液脓血便消失，大便成形，个别见有软便。造模过程中，模型组及清肠栓组各死亡1只。

　　2．2 各组结肠大体形态评分比较见表1。正常组为正常黏膜组织，模型组黏膜糜烂较重，溃疡多而且大，黏膜严重充血、水肿；清肠栓组黏膜糜烂不严重。溃疡小，黏膜充血、水肿程度轻；西药组黏膜糜烂程度减轻，溃疡数量少，黏膜充血、水肿程度较模型组轻浅。根据肉眼观察各组结肠黏膜损伤情况评分结果提示．模型对照组积分值最高，与正常组差异有统计学意义(P<0．05)；经给药后各组积分则呈明显降低趋势，与模型组差异有统计学意义(P<0．05)；清肠栓组与SASP组相当(P>0．05)，说明经治疗后结肠黏膜修复明显，炎症控制，但尚未完全恢复正常。

　　3 讨论研究表明，UC急性期病理表现为大量炎症细胞浸润(以中性粒细胞及淋巴细胞为主) ]。这些炎症细胞可以释放炎症介质、细胞因子等物质，可进一步加重局部炎症反应。血液中的中性粒细胞必须在穿过毛细血管壁进入组织间隙被活化后才能发挥生物学效应。中性粒细胞具有很强的趋化作用。其中对中性粒细胞起趋化作用的物质称为中性粒细胞趋化因子。IL一8是最强的中性粒细胞趋化因子，通过与其受体的交互作用，IL一8可以趋化中性粒细胞向病变结肠黏膜聚集?，同时IL一8能激活中性粒细胞．促进中性粒细胞呼吸爆发，产生大量毒性物质，加重炎症反应。UC病变肠黏膜的IL一8水平明显高于正常组织，且与黏膜的中性粒细胞数、病灶的大体炎症程度呈正相关。需要指出的是大鼠无IL一8的表达．中性粒细胞趋化因子CINC是一种和人IL一8很相似的鼠蛋白，被看作是IL一8家族的一员。基于大鼠模型的实验将CINC作为UC样肠炎的标志物[5]。研究表明，CINC在葡聚糖硫酸钠(DSS)饲喂的大鼠肠黏膜增多并且与肉眼分级和炎症部位浸润中性粒细胞的数目相关[6]。

　　清肠栓是龙华医院治疗UC的中医特色制剂，由青黛、马齿苋、参三七、五倍子组成，具清热解毒、活血祛瘀、祛腐生新、生肌愈溃之功效。该复方制剂能够迅速缓解UC急性发作的症状，起到止痛止血止泻的作用，临床效果显着。本研究在以往相关研究的基础上，旨在从中性粒细胞趋化因子的角度解释其治疗机理。

　　研究结果，结肠CINC一1的ELSIA定量模型组较正常组明显增高，经过清肠栓及SASP治疗后，该指标有所降低。但仍未降至正常水平，提示治疗药物可以调控CINC一1的蛋白含量，其机理可能是下调CINC-l表达量后．减少了趋化到病变结肠黏膜的中性粒细胞的数量，组织持续损伤因此得以缓解。该结果符合实验预期。说明趋化性细胞因子在UC发病中起到了重要的作用，尤其在UC急性发作期，CINC对于PMN的趋化起到了关键作用。根据研究结果推测，清肠栓可以降低大鼠病变部结肠黏膜显着增高的CINC一1的蛋白含量，这可能是清肠栓治疗UC急性发作的机理之一。（参考文献：清肠栓对大鼠溃疡性结肠炎急性期模型CINC一1的影响，谢建群，中国中医急症2014年6月第23卷第6期）